Chromatographie ist eine der Methoden zur Stofftrennung. Es dient der anschließenden qualitativen und quantitativen Analyse der physikalischen und chemischen Eigenschaften von Mikropartikeln. Eine Variation dieser Technologie ist die Affinitätschromatographie. Die Idee, Proteinverbindungen anhand der Eigenschaft der molekularen Affinität zu differenzieren, ist in der Wissenschaft seit mehreren Jahrzehnten bekannt. Es hat seine Entwicklung jedoch erst in den letzten Jahren erh alten, nach der Einführung von hochporösen hydrophilen Materialien, die als Matrix verwendet werden. Mit dieser Methode lassen sich sowohl analytische Probleme (Trennung von Stoffen und deren Identifizierung) als auch präparative Probleme (Reinigung, Konzentration) lösen.
Essenz
Affinitätschromatographie (vom lateinischen Wort affinis - „benachbart“, „verwandt“) basiert auf affinen Wechselwirkungen, also der Bildung hochspezifischer Bindungen zwischen einem Abstandsh altermolekül (Ligand oder Affinant) und einem Zielmolekül. Diese Mechanismen sind in der Natur weit verbreitet (Verbindung von Mediatoren oder Hormonen und Rezeptoren, Antikörpern uAntigene, Hybridisierung von Polynukleotiden und andere Arten von Prozessen). In der Medizin wird die Affinitätschromatographie seit 1951 praktisch eingesetzt
Die Komponenten werden wie folgt getrennt:
- Arbeitslösung mit der zu isolierenden Substanz wird durch das Sorbens geleitet;
- auf der Sorbensmatrix abgelagerter Ligand hält diese Substanz zurück;
- es wird konzentriert (Akkumulation);
- Extraktion der isolierten Substanz aus dem Sorbens durch Waschen mit einem Lösungsmittel.
Mit dieser Methode können Sie ganze Zellen isolieren. Der Unterschied zur herkömmlichen Sorptionschromatographie besteht in einer starken biospezifischen Bindung der isolierten Komponente an das Sorbens, die sich durch eine hohe Selektivität auszeichnet.
Adsorptionsmittel
Als Adsorptionsmittel werden folgende Stoffe verwendet:
- Gelverbindungen auf Basis von Agarose, einem aus Agar gewonnenen Polysaccharid. Die am häufigsten verwendeten sind 3 Sorten: Sepharose 4B, CL (quervernetzte Agarose) und Affi-Gel. Die letztere Zusammensetzung ist ein modifiziertes Gel aus Agarose und Polyacrylamid. Es hat eine größere biologische Inertheit, eine hohe chemische und thermische Beständigkeit.
- Silica (Kieselgel).
- Glas.
- Organische Polymere.
Um mechanische Hindernisse beim Ligandenkontakt zu beseitigen, werden zusätzliche Substanzen verwendet, um ihn vom Träger zu trennen (Peptide, Diamine, Polyamine, Oligosaccharide).
Ausrüstung
Affinitätschromatographie-Ausrüstung umfasst die folgenden Haupteinheiten:
- Vorratsbehälter für die mobile Phase (Eluent);
- Hochdruckpumpen zur Medienversorgung (meistens hin- und hergehend);
- Filter zur Reinigung von Eluenten von Staub;
- Dosiergerät;
- Chromatographiesäule zur Gemischtrennung;
- Detektor zum Nachweis getrennter Komponenten, die die Säule verlassen;
- Chromatogrammschreiber und Mikroprozessoreinheit (Computer).
Um die Menge an gelöster Luft zu reduzieren, wird zunächst Helium durch die mobile Phase geleitet. Um die Konzentration des Eluenten zu verändern, sind mehrere vom Programmer gesteuerte Pumpen installiert. Chromatographiesäulen werden aus Edelstahl (für erhöhte Anforderungen an die Korrosionsbeständigkeit), Glas (Universaloption) oder Acryl hergestellt. Für präparative Zwecke kann ihr Durchmesser von 2 bis 70 cm variieren, in der analytischen Chromatographie werden Mikrosäulen Ø10-150 µm verwendet.
Um die Empfindlichkeit der Detektoren zu erhöhen, werden Reagenzien in die Mischung eingebracht, die zur Bildung von Substanzen beitragen, die mehr Strahlen im ultravioletten oder sichtbaren Bereich des Spektrums absorbieren.
Methodik
Es gibt 2 Hauptarten der Flüssigkeitsaffinitätschromatographie:
- Säule, bei der die Säule mit einer stationären Phase gefüllt wird und ein Gemisch durchströmt wirdElutionsmittel. Die Trennung kann unter Druck oder Schwerkraft erfolgen.
- Dünne Schicht. Der Eluent bewegt sich unter dem Einfluss von Kapillarkräften entlang der ebenen Adsorptionsmittelschicht. Das Adsorptionsmittel wird auf eine Glasplatte, einen Keramik- oder Quarzstab, eine Metallfolie aufgetragen.
Zu den wichtigsten Arbeitsschritten gehören:
- Herstellung des Adsorptionsmittels, Fixierung des Liganden auf dem Träger;
- Zuführung des Trenngemisches zur Chromatographiesäule;
- Laden der mobilen Phase, Komponentenbindung durch Liganden;
- Phasenaustausch zur Isolierung der gebundenen Substanz.
Ziel
Affinitätschromatographie wird verwendet, um die folgenden Arten von Substanzen zu isolieren (die Art des verwendeten Liganden ist in Klammern angegeben):
- Analoga enzymatischer Inhibitoren, Substrate und Cofaktoren (Enzyme);
- bioorganische Substanzen mit Anzeichen genetischer Fremdheit, Viren und Zellen (Antikörper);
- hochmolekulare Kohlenhydrate, Monosaccharidpolymere, Glykoproteine (Lektine);
- Kernproteine, Nukleotidyltransferasen (Nukleinsäuren);
- Rezeptoren, Transportproteine (Vitamine, Hormone);
- Proteine, die mit Zellmembranen (Zellen) interagieren.
Diese Technologie wird auch verwendet, um immobilisierte Enzyme zu erh alten, und ihre Bindung an Zellulose ermöglicht die Herstellung von Immunosorbentien.
Chromatographie von DNA-bindenden Proteinen
Die Isolierung von DNA-bindenden Proteinen erfolgt mitHeparin. Dieses Glykosaminoglykan ist in der Lage, eine Vielzahl von Molekülen zu binden. Die Affinitätschromatographie von Proteinen dieser Gruppe dient der Isolierung von Substanzen wie:
- Faktoren der Initiation und Elongation der Translation (Synthese von Nukleinsäuremolekülen und Proteinen);
- Restrictasen (Enzyme, die bestimmte Sequenzen in doppelsträngiger DNA erkennen);
- DNA-Ligasen und -Polymerasen (Enzyme, die die Verbindung zweier Moleküle zu einer neuen chemischen Bindung katalysieren und an der DNA-Replikation beteiligt sind);
- Serinprotease-Inhibitoren, die eine wichtige Rolle bei Immun- und Entzündungsprozessen spielen;
- Wachstumsfaktoren: Fibroblast, Schwann, Endothel;
- Proteine der extrazellulären Matrix;
- Hormonrezeptoren;
- Lipoproteine.
Würde
Diese Methode ist eine der spezifischsten für die Isolierung reaktiver Verbindungen (Enzyme und größere Aggregate - Viren). Es wird jedoch nicht nur zur Isolierung biologisch aktiver Substanzen verwendet.
Nachweis von Antikörpern in kleinen Mengen, quantitative Bestimmung von Polyadenylsäure, schnelle Bestimmung der Molekülmassen von Dehydrogenasen, Entfernung bestimmter Schadstoffe, Untersuchung der Aktivierungskinetik der inaktiven Form von Trypsin, der molekularen Struktur des Menschen Interferone – dies ist nicht die ganze Liste von Studien, in denen Affinität verwendet wird. Der Einsatz in der Klinik liegt an seinen Vorteilen wie:
- Effektive ReinigungsfähigkeitProteine, Polysaccharide, Nukleinsäuren. Sie unterscheiden sich geringfügig in ihren physikalischen und chemischen Eigenschaften und verlieren an Aktivität während der Hydrolyse, Denaturierung und anderer Behandlungsarten, die in anderen Methoden verwendet werden.
- Die Geschwindigkeit der Stofftrennung, die Dynamik des Prozesses.
- Keine Notwendigkeit für spezielle Enzymreinigung und Isoenzymhomogenisierung zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten.
- Kann eine Vielzahl von Stoffen trennen.
- Geringer Ligandenverbrauch.
- Möglichkeit der Stofftrennung in großen Volumina.
- Reversibler Prozess der Bindung biologischer Makromoleküle.
Diese Technik kann mit anderen kombiniert werden, um ein zusätzliches Feld (Gravitation, elektromagnetisch) aufzuerlegen. Damit erweitern Sie die technischen Möglichkeiten der Chromatographie.
Enzymatisches Engineering
Dank dieser Methode begann die aktive Entwicklung eines neuen Zweigs der Biotechnologie - des Enzym-Engineerings.
Affinitätschromatographie zur Enzymisolierung hat folgende Vorteile:
- Erlangung von Enzymen in großen Mengen aufgrund kürzerer Zeit, als Ergebnis - deren Preissenkung;
- Immobilisierung von Enzymen kann deren Anwendungsbereich in Medizin und Industrie erheblich erweitern;
- Die Assoziation von Enzymen mit einem unlöslichen festen Träger ermöglicht es, den Einfluss der Mikroumgebung und die Richtung von Reaktionen zu untersuchen, die eine wichtige Rolle in natürlichen und physiologischen Prozessen spielen.
