PCR oder Polymerase-Kettenreaktion ist eine ausgeklügelte Labortechnik, die in der Medizin und anderen wissenschaftlichen Bereichen weit verbreitet ist. Die PCR-Diagnostik wurde einst zu einem echten Durchbruch in der Wissenschaft.
Beschreibung
Quantitative PCR ist eine Art Echtzeit-PCR.
Dabei versteht man eine Variante der PCR, bei der die Kinetik der Reaktion ständig aufgezeichnet wird, was es ermöglicht, den Geh alt bestimmter DNA-Nukleotidsequenzen in einem komplexen Molekülgemisch qualitativ zu bewerten.
Quantitative PCR-Verfahren werden weiter unten ausführlicher besprochen.
Die Essenz der Analyse
Kulturelle und serologische Methoden werden besonders häufig zur Diagnose von Infektionen eingesetzt. Bei der ersten werden Antikörper gegen einen Infektionserreger im Blutserum bestimmt. Im zweiten wird biologisches Material, das einem Kranken entnommen wurde, verwendet, um ein spezifisches Medium zu säen, das für das Wachstum von Krankheitserregerkolonien günstig ist. Diagnose in beidenFall kann Tage oder Wochen dauern.
PCR-Untersuchung kann mit verschiedenen biologischen Materialien durchgeführt werden, die von einer kranken Person gewonnen werden. Als Proben dienen Blut und andere pathologische, physiologische und biologische Medien und Flüssigkeiten. Sie können PCR-Kot oder -Urin machen.
Atypische und virale Infektionen werden am häufigsten durch quantitative PCR diagnostiziert, da sie aufgrund der spezifischen Art des durch sie hervorgerufenen pathologischen Prozesses möglicherweise nicht einfach zu diagnostizieren sind. Um solche Infektionen zu bestimmen, braucht es Zeit, während der Antikörper im Körper produziert werden, die durch serologische Methoden bestimmt werden. Dies ist jedoch in manchen Fällen nicht akzeptabel.
Art der Durchführung
PCR-Methode - Labornachweis einer Infektion in vom Patienten isolierten Proben (in vitro).
Um eine Polymerase-Kettenreaktion durchzuführen, ist ein Satz spezieller Reagenzien erforderlich.
Das Untersuchungsmaterial wird in Reagenzgläser mit Reagenzien gegeben. Die Reagenzgläser werden in ein spezielles Gerät gestellt - einen PCR-Verstärker, der zur Amplifikation (Erhöhung der Anzahl) der gewünschten RNA- oder DNA-Fragmente bestimmt ist, der PCR-Verstärker arbeitet in einem zyklischen Modus. Wenn die Proben in jedem Zyklus die RNA- oder DNA-Sequenz des Krankheitserregers enth alten, sammeln sich immer mehr Kopien der Partikel dieser Nukleinsäuren in der Lösung an. Sie können das Vorhandensein des Erregers und seine Menge in den Proben bestimmen.
PCR-Typen
Qualitative Analyse durch PCR ermöglicht folgendes Ergebnis:
- negativ, wenn der interessierende Erreger nicht in den Proben gefunden wird;
- positiv, wenn in den Proben Sequenzen gefunden werden, die für einen bestimmten Erreger charakteristisch sind.
Bei einem positiven PCR-Ergebnis können wir mit einer Genauigkeit von 95 % über das Vorliegen einer diagnostizierten Infektion sprechen. Gleichzeitig erreicht die Genauigkeit von PCR-Sets, die für diagnostische Zwecke verwendet werden, 100 %.
Normalerweise werden 5 % der falschen Ergebnisse durch den menschlichen Faktor bestimmt. Beispielsweise können Verstöße gegen die Analysetechnik und die Lagerung von Reagenzien die Genauigkeit der Studie erheblich verringern.
Quantitative PCR definiert das Konzept der Viruslast. Es ist möglich, festzustellen, wie viele Sätze von Erreger-DNA in den dem Patienten entnommenen Proben enth alten waren.
Die Schwere der Infektion ist direkt proportional zur Zunahme ihrer Anzahl. Auch den Therapieerfolg zur Reduzierung der Viruslast können Sie bestimmen.
Einreichung für PCR-Biomaterial
Quantitative PCR wird in der Klinik hauptsächlich morgens durchgeführt. Beim Arztbesuch wird dem Patienten mitgeteilt, was entnommen werden muss: Abstriche, Abstriche, Urin oder Blut. PCR kann Krankheitserreger unabhängig vom Kontaminationsgrad des Materials nachweisen.
Für eine positive Analyse ist theoretisch das Vorhandensein nur eines Erregers in den Proben erforderlich. In der Praxis versuchen sie, noch günstigere Bedingungen zu schaffen. Dafür gibt es einige Empfehlungen:
- wenn sie ein Kratzen oder einen Abstrich von den Genitalien nehmenOrgane, müssen Sie drei Tage vor der Studie auf intimen Geschlechtsverkehr verzichten;
- Sie können nicht mit antibakteriellen Medikamenten duschen oder sich vor der Analyse waschen;
- drei Stunden vor der Entnahme eines Abstrichs aus der Harnröhre müssen Sie geduldig sein und Ihren Darm nicht entleeren.
Befolgen Sie diese Regeln nicht, wenn Sie Blut spenden.
Wie werden die Ergebnisse der quantitativen PCR-Analyse interpretiert?
Quantitative Auswertung der erzielten Ergebnisse
In einer Reihe klinischer Situationen tritt das Problem der Wirksamkeit der Behandlung und / oder der Dynamik des pathologischen Prozesses auf. Solche Fragen sind besonders relevant bei der Untersuchung von Menschen mit chronischen Infektionen (Human Immunodeficiency Virus, Hepatitis B und C). Bei der Diagnose basieren sie auf der Tatsache, dass die Akkumulation von Amplikons (PCR-Produkten) proportional zum Vorhandensein von Kopien des gewünschten Gens in der analysierten Probe ist.
Die Berücksichtigung der Ergebnisse der quantitativen PCR erfolgt natürlich durch Gelelektrophorese mit der Untersuchung der Intensität spezieller PCR-Signale. Voraussetzung für eine korrekte quantitative Bewertung der erzielten Ergebnisse sind außerdem positive zuverlässige Kontrollproben, die eine bekannte Kopienzahl des gewünschten Gens enth alten (z. B. tausend Kopien des Hepatitis-C-Gens für eine PCR-Reaktion). Mehrere Verdünnungsreihen der quantitativen Kontrolle ermöglichen die Erstellung von Eichkurven und dienen zur Beurteilung des Inh alts klinischer Genokopien in klinischen Proben.
In der Definition der quantitativen PCR war die Schaffung eine Schlüsselleistungfluoreszierende DNA-Sonden, die gleichzeitig mit einfachen Primern zum Reaktionsgemisch gegeben werden und es Ihnen ermöglichen, den PCR-Prozess zeitlich zu verfolgen, d. h. Echtzeit-PCR.
Die TaqMan-Methodik bezieht sich auf die Synthese von fluoreszierenden DNA-Sonden, die spezifisch für den mittleren Teil des Amplikons sind und zwei Markierungen an den Enden haben. Eines davon ist ein Fluoreszenzmarker, das zweite ein Quencher-Molekül für diese Fluoreszenz.
Ein spezielles Gerät, das ein Hybrid aus Fluorimeter und Thermoblock-Verstärker ist, misst ständig die Fluoreszenz in jedem Reagenzglas (Real-Time-PCR-Prinzip). Nach 20-40 PCR-Zyklen werden für jede Probe individuelle Kurven erh alten. Aus Eichkurven mit Kontrollproben lässt sich die Kopienzahl des gewünschten Gens berechnen, die in der Testprobe enth alten ist.
Ein wichtiges Merkmal der Durchführung der PCR nach der Fluoreszenzmethode ist auch, dass bei der Berücksichtigung der Ergebnisse keine Röhrchen mit einer PCR-Mischung geöffnet werden müssen. Dadurch wird die Möglichkeit einer Raumkontamination mit Amplifikationsprodukten verringert, und es müssen keine speziellen Arbeitsbereiche für die Elektrophorese zugewiesen werden.
Was zeigt ein quantitatives PCR-Transkript?
Was wird entdeckt?
Durch eine Methode wie quantitative PCR werden qualitative Veränderungen in Genen gefunden: Insertionen, Deletionen und Punktmutationen. Aber bei einigen Erbkrankheiten treten die entsprechenden Symptome als Reaktion auf eine Veränderung im Inh alt bestimmter Gene auf.
DankeDie quantitative Analyse ergibt ein numerisches Ergebnis, meistens in IE / ml. Das bedeutet, dass in einem Milliliter der Untersuchungsprobe eine bestimmte Anzahl von Kopien der RNA oder DNA des Erregers, gemessen in internationalen Einheiten, gefunden wurde.
Je nach Ausmaß wird die Schwere der Infektion diagnostiziert. Blut wird normalerweise getestet, um die Viruslast zu bestimmen, da sich Viren während einer Krankheit frei im Blut bewegen.
Funktionen
Quantitative PCR in einem Bluttest hat zwei Merkmale.
- Die Analyse wird in Gegenwart von Primern oder Desoxyribonukleosidtriphosphaten durchgeführt, die mit einem fluoreszierenden oder radioaktiven Marker markiert sind, um den Geh alt des gebildeten PCR-Produkts genau zu bestimmen.
- Beenden Sie im PCR-Prozess die Reaktion frühzeitig, bevor zu viele PCR-Produkte erscheinen. Dies liegt daran, dass im Endstadium der Sättigung, wenn viele PCR-Produkte vorhanden sind, sowohl das Enzym selbst als auch die Substrate als begrenzende Glieder dieser Reaktion wirken. Das Ende des nächsten PCR-Zyklus ist unter solchen Bedingungen nicht mehr durch eine Verdopplung der Zahl der PCR-Produkte gekennzeichnet, unbedeutende quantitative Unterschiede zwischen verschiedenen Proben werden ausgeglichen, die in den frühen Stadien nach Durchlaufen einer Reihe von Reaktionszyklen recht deutlich ausgeprägt sind.
Kosten der PCR-Diagnostik
PCR-Forschung ist mit Kosten verbunden, die davon abhängen, welche Art von Infektion getestet wird, von der Analysemethode und dem Testmaterial. Um eine Infektion festzustellen, müssen Sie nachgeben200-800 Rubel. Eine Gebühr für die Entnahme von Biomaterial wird ebenfalls hinzugefügt - ungefähr 400 Rubel.
