Durchflusszytometrie ist eine zytologische Forschungsmethode, die für eine gründliche Analyse von Zellen verwendet wird. Sein Vorteil ist, dass Sie jede Zelle einzeln untersuchen können. Diese Art der Analyse hilft, mehrere Parameter in Hunderten von Zellen in Sekundenschnelle auszuwerten. Aus diesem Grund gilt die Zytofluorimetrie als eine der schnellsten und genauesten Analysemethoden, die Wissenschaftlern und Klinikern derzeit zur Verfügung stehen.
Prinzip
Das Prinzip der Durchflusszytometrie basiert auf der Messung der Lichtstreuung und der Lumineszenz (Fluoreszenz) von Zellen. Die Zellsuspension wird als Strahl mit hoher Geschwindigkeit durch die Zytometerzelle geleitet und dort mit einem Laser bestrahlt. Dort wird auch die sogenannte hydrodynamische Fokussierung durchgeführt. Sein Mechanismus besteht darin, dass die Strömung aus der Zelle mit den untersuchten Partikeln am Auslass in den externen Strahl fließt, der eine höhere Geschwindigkeit hat. Dadurch werden Partikel in einer geordneten Kette angeordnet.
Vorzellen werden mit speziellen Fluoreszenzfarbstoffen (Fluorochrome) markiert. Dank ihnen der Laserstrahlerregt ein Sekundärglühen. Die empfangenen Lichtsignale werden von Detektoren registriert. Anschließend werden die Informationen mithilfe von Softwarealgorithmen verarbeitet, die es Ihnen ermöglichen, einzelne Zellpopulationen zu zählen, die sich in einigen Kriterien unterscheiden.
Forschung mit herkömmlicher Mikroskopie kann oft nicht zwischen verschiedenen Zellen unterscheiden, weil sie gleich aussehen. Zytofluorimetrie kann andere Daten liefern (DNA-Strukturintegrität), Proteinexpression und Zellüberleben analysieren.
Da die Anregung von Fluorochromen Lichtstrahlen mit unterschiedlichen Wellenlängen sowie unterschiedliche Arten von Detektoren erfordert, sind moderne Anlagen mit mehreren Detektionskanälen (von 4 bis 30) ausgestattet. Die Anzahl der Laser-Emitter kann zwischen 1 und 7 liegen. Komplexere Geräte ermöglichen Multiparameter-Untersuchungen mehrerer Eigenschaften von Partikeln gleichzeitig.
Vor- und Nachteile
Zu den Vorteilen der Durchflusszytometrie gehören:
- hohe Verarbeitungsgeschwindigkeit (Registrierung von bis zu 30.000 Ereignissen in 1 Sekunde);
- Möglichkeit, eine große Anzahl von Zellen zu untersuchen (bis zu 100 Millionen in einer Probe);
- Quantifizierung der Intensität von Fluoreszenzlicht;
- Analyse jeder Zelle;
- simultane Untersuchung heterogener Prozesse;
- automatische Trennung der Daten nach Zellpopulationen;
- Qualitätsvisualisierung der Ergebnisse.
Ein weiteres Merkmal dieser Technologie ist dasDas analysierte Partikel kann mit mehreren fluoreszierenden Lösungen angefärbt werden. Dadurch entsteht eine Multiparameterstudie.
Nachteilig sind die Komplexität der technischen Ausstattung und die Notwendigkeit einer speziellen Probenvorbereitung.
Zytometer
Die ersten Geräte dieser Art tauchten bereits 1968 in Deutschland auf, verbreiteten sich aber erst viel später. Derzeit können alle Geräte, die nach der Methode der Durchflusszytometrie arbeiten, in 2 Typen unterteilt werden:
- Geräte, die fluoreszierende Strahlung (zwei oder mehr Wellenlängen), 10°- und 90°-Lichtstreuung (Low Angle and Side Scatter Detektor) messen;
- Geräte, die neben der Messung mehrerer zellulärer Parameter automatisch nach diesen Kriterien in Gruppen einsortiert werden.
Der Vorwärtsstreuungsdetektor dient zur Bestimmung der Zellgröße, und der Seitenstreuungsdetektor ermöglicht es Ihnen, Informationen über das Vorhandensein von intrazellulären Granula, das Volumenverhältnis des Zytoplasmas und des Zellkerns zu erh alten.
Klassische Zytometer ermöglichen es im Gegensatz zu Lichtmikroskopen nicht, ein Bild einer Zelle zu erh alten. In den letzten Jahren wurden jedoch kombinierte Geräte entwickelt, die in der Lage sind, die Fähigkeiten eines Mikroskops und eines Cytofluorimeters zu kombinieren. Sie werden weiter unten besprochen.
Bildgebende Zytometer
Für Instrumente, die in der klassischen Durchflusszytometrie verwendet werden,Ein Merkmal ist charakteristisch: Wenn in der Population der analysierten Zellen seltene Ereignisse registriert werden, gibt es keine Möglichkeit, ihre Essenz zu beurteilen. Diese Partikel können entweder die Überreste toter Zellen oder eine seltene Gruppe von ihnen sein. Bei herkömmlichen Geräten sind solche Daten vom allgemeinen Ereignisfluss ausgeschlossen, aber gerade sie können für die wissenschaftliche und klinische Analyse von besonderem Wert sein.
Mit der neuen Generation von bildgebenden Durchflusszytometern können Sie ein Bild jeder Zelle aufnehmen, die im Fluss durch die Detektorzone strömt. Es ist leicht zu sehen, indem Sie auf den entsprechenden Bereich des Diagramms klicken, der auf dem Computermonitor angezeigt wird.
Anwendungsbereiche
Durchflusszytometrie ist eine universelle Methode, die in vielen Bereichen der Medizin und Wissenschaft Anwendung findet:
- Immunologie;
- Onkologie;
- Transplantologie (Transplantation von rotem Knochenmark, Stammzellen);
- Hämatologie;
- Toxikologie;
- Biochemie (Messung des Säuregeh alts in der Zelle, Untersuchung anderer Parameter);
- Pharmakologie (Entwicklung neuer Medikamente);
- Mikrobiologie;
- Parasitologie und Virologie;
- Ozeanologie (die Untersuchung des Phytoplanktons zur Beurteilung des Zustands von Gewässern und andere Aufgaben);
- Nanotechnologie und Mikropartikelanalyse.
Immunologie
Das menschliche Immunsystem besteht aus einer Vielzahl von Zellen. Die Durchflusszytometrie in der Immunologie ermöglicht es, ihre Struktur und Funktionen zu bewerten, dh morphofunktional durchzuführenAnalyse.
Solche Forschung hilft, die komplexe Natur der Immunität zu verstehen. Zellphänotypen ändern sich als Ergebnis der Aktivierung durch Antigene, der Entwicklung von Pathologien und anderen Faktoren. Zytofluorometrie kann Subpopulationen von Immunzellen in einer komplexen Mischung trennen und alle ihre Veränderungen im Laufe der Zeit bewerten.
Onkologie
Eine der wichtigsten Aufgaben in der Onkologie ist die Differenzierung von Zellen nach ihrem Typ. Das Prinzip der durchflusszytometrischen Analyse in der Onkohämatologie beruht auf folgendem Phänomen: Wird eine Probe mit einem speziellen Fluoreszenzfarbstoff behandelt, bindet dieser an zytoplasmatische Proteine. Nach der Teilung in aktiv proliferierenden Zellen nimmt sein Inh alt um die Hälfte ab. Dementsprechend nimmt die Intensität der Zelllumineszenz um das Doppelte ab.
Es gibt andere Möglichkeiten, proliferierende Zellen zu erkennen:
- Verwendung von DNA-bindenden Farbstoffen (Propidiumiodid);
- Verwendung von markiertem Uracil;
- Registrierung einer erhöhten Expression von Cyclin-Proteinen, die an der Regulation des Zellzyklus beteiligt sind.
